Введение

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) остаётся одной из наиболее значимых медико-биологических проблем современности.

Несмотря на развитие антиретровирусной терапии, заболевание продолжает распространяться, что делает актуальным изучение факторов, влияющих на восприимчивость человека к инфекции. Особый интерес представляет генетическая изменчивость организма, в частности мутации, способные снижать риск инфицирования.

Одним из наиболее изученных генетических вариантов является мутация CCR5Δ32 — делеция длиной 32 пары нуклеотидов в гене рецептора CCR5. Данный рецептор участвует в проникновении ВИЧ в клетку, а его структурные изменения могут приводить к снижению или полной утрате функциональной активности белка. В результате у носителей мутации наблюдается частичная или выраженная устойчивость к заражению определёнными штаммами вируса.

Механизм действия мутации CCR5Δ32

CCR5Δ32 — это делеция 32 пар нуклеотидов в гене CCR5, который кодирует рецептор CCR5. Этот белок экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов и макрофагов — клеток, через которые ВИЧ-1 чаще всего проникает в организм.

Для проникновения в клетку ВИЧ-1 использует два рецептора:

1. CD4 — основной рецептор на Т-лимфоцитах. Вирус ВИЧ связывается с CD4, что запускает конформационные изменения белка.
2. CCR5 — корецептор, необходимый для окончательного слияния вирусной оболочки с мембраной клетки. CCR5 действует как «второй замок»: без него вирусы в целом не могут привести к внедрению вирусной РНК.

В нормальной клетке вирус сначала прикрепляется к CD4, затем взаимодействует с CCR5, открывая путь для слияния мембран и ввода вирусной РНК в цитоплазму. После этого запускается жизненный цикл вируса: обратная транскрипция, интеграция в ДНК хозяина, синтез вирусных белков и сборка новых вирусных частиц.

Как действует мутация CCR5Δ32

У гомозиготных носителей CCR5Δ32 происходит следующее:

— Белок CCR5 либо не синтезируется, либо не транспортируется на мембрану клетки

— ВИЧ-1 не может найти «второй замок», поэтому слияние вируса с клеткой не происходит

— В результате клетки остаются невосприимчивыми к инфекционному воздействию вируса

У гетерозиготных носителей:

— CCR5 экспрессируется частично

— Вирус может инфицировать клетку, но процесс замедлен, вирусная нагрузка снижается, а прогрессирование болезни замедляется

Методы определения мутации CCR5Δ32 у человека

Изучение мутации CCR5Δ32, связанной с устойчивостью к ВИЧ-инфекции, требует применения современных молекулярно-биологических методов. Основная цель таких исследований — выявление наличия или отсутствия делеции 32 нуклеотидов в гене CCR5, а также определение генотипа исследуемого: гомозиготный или гетерозиготный. Для этого используется комплекс методов, включающий: выделение ДНК, амплификацию фрагмента с помощью ПЦР и визуализацию результатов электрофорезом.

1. Выделение ДНК

Выделение ДНК — это первый и критически важный этап, так как от качества исходного материала зависит успешность последующих процедур. Для анализа мутации CCR5Δ32 чаще всего используют биологический материал, легко доступный у человека, например, эпителиальные клетки ротовой полости или кровь.

Принцип метода:

1. Лизис клеток: Клетки разрушаются с помощью специальных буферов, содержащих детергенты и протеиназу. Это позволяет разрушить клеточные мембраны, расщепить белки и освободить генетический материал.
2. Сорбция ДНК: при добавлении гуанидиновых солей и спирта ДНК адсорбируется на поверхности колонки с определенным гелем. Белки, липиды и другие примеси смываются промывкой.
3. Очищенная ДНК снимается с колонки буфером или водой, готовая к использованию в ПЦР.

2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР — это метод, разработанный Кэри Муллисом в 1983 году, который революционизировал молекулярную биологию. Он позволяет избирательно размножить конкретные фрагменты ДНК до миллионов копий, обеспечивая высокую чувствительность и специфичность анализа.

Принцип метода:

1. Денатурация: Двунитевые молекулы ДНК разъединяются при высокой температуре (≈94–95 °C)
2. Отжиг праймеров: Специфические короткие последовательности ДНК (праймеры) комплементарно присоединяются к целевому участку
3. ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, используя матрицу

Циклическое повторение этих этапов обеспечивает экспоненциальное увеличение целевого фрагмента.

Особенности метода:

— Высокая специфичность: Праймеры нацелены только на участок гена CCR5, содержащий потенциальную делецию.

— Чувствительность: Позволяет работать с минимальными количествами ДНК.

— Диагностическая ценность: Позволяет различать гетерозиготные и гомозиготные варианты, так как длина амплифицированного фрагмента зависит от наличия или отсутствия мутации.

Применение к CCR5Δ32:

— Мутация CCR5Δ32 вызывает укорочение фрагмента ДНК на 32 нуклеотида.

— После амплификации фрагмента с помощью ПЦР нормальный аллель и мутантный аллель (Δ32) отличаются по длине, что позволяет различать их при визуализации.

— Этот метод используется в крупных популяционных исследованиях для оценки распространённости мутации и определения генетического риска.

3. Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез — метод разделения ДНК по размеру фрагментов под действием электрического поля. Является стандартным методом регистрации результатов ПЦР.

Принцип работы:

1. ДНК имеет отрицательный заряд, поэтому движется к положительному электроду.
2. Сетка пор агарозного геля замедляет движение крупных молекул, тогда как мелкие проходят быстрее.
3. Интеркалирующие красители (бромистый этидий, SYBR Green) связываются с ДНК и флуоресцируют под ультрафиолетом, визуализируя полосы на геле.

Исторический аспект

Электрофорез впервые был применён к нуклеиновым кислотам в 1960-х. Агарозные гели быстро стали стандартом для анализа ПЦР-продуктов благодаря простоте приготовления, низкой токсичности и возможности разделения фрагментов длиной 100–3000 нуклеотидов. Полиакриламидные гели дают более высокое разрешение, но сложны в работе, поэтому в диагностике мутации CCR5Δ32 предпочтение отдается агарозному гелю.

Применение к CCR5Δ32:

— После ПЦР на геле формируются полосы: нормальный аллель длиннее на 32 нуклеотида, мутантный — короче.

— Гетерозиготный носитель проявляется двумя полосами одновременно.

— Позволяет оценить относительное количество амплифицированного продукта (яркость полос).

Дополнительные модификации:

1. Пульс-электрофорез (PFGE): используется для крупных фрагментов ДНК, изучения перестроек генома, но для стандартной ПЦР CCR5Δ32 применяют классический горизонтальный агарозный электрофорез.
2. Вертикальный полиакриламидный электрофорез: позволяет различать фрагменты, отличающиеся на 1 нуклеотид, но редко используется для рутинной диагностики.

4. Применение методов в исследовании мутации CCR5Δ32

Совокупность методов позволяет: надежно выявлять мутацию даже при малом количестве исходной ДНК, различать генотипы: гомозиготные и гетерозиготные носители, а также контролировать качество анализа: визуализация на геле и внутренние стандарты обеспечивают достоверность результатов.

Литература:

1. Красильникова И. В., Пешикова М. В. История возникновения проблемы ВИЧ / СПИДа // Вестник СМУС74. 2018. № 2 (21). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/istoriya-vozniknoveniya-problemy-vich-spida (дата обращения: 02.03.2026).
2. Гащенко, А. И. Пандемия. ВИЧ. История, проблемы, надежды / А. И. Гащенко, В. В. Леонова, О. Недялков // Проблемы развития современного общества: Сборник научных статей 7-й Всероссийской национальной научно-практической конференции. В 5-ти томах, Курск, 20–21 января 2022 года / Под редакцией В. М. Кузьминой. Том 4. — Курск: Юго-Западный государственный университет, 2022. — С. 176–178. — EDN RVQEXD.
3. Коваленко, Ю. А. ВИЧ-инфекция, история развития пандемии / Ю. А. Коваленко, М. С. Агапова // Неделя молодежной науки — 2021: Материалы Всероссийского научного форума с международным участием, посвященного медицинским работникам, оказывающим помощь в борьбе с коронавирусной инфекцией, Тюмень, 26–28 марта 2021 года. — Тюмень: Рекламно-издательский центр «Айвекс», 2021. — С. 342. — EDN XYOXFR.
4. Хачатрян, А. А. Роль корецептора CCR5 в лечении и профилактике ВИЧ / А. А. Хачатрян // Молодежь в науке: Новые аргументы: Сборник научных работ VI Международного молодежного конкурса, Липецк, 30 апреля 2017 года / Ответственный редактор А. В. Горбенко. Том часть II. — Липецк: Научное партнерство «Аргумент», 2017. — С. 19–23. — EDN ZBPGCF.
5. Ж. С. Нугманова, Н. О. Накисбеков, Г. М. Ахметова, Ш. М. Нурмолдин, Н. Г. Ковтуненко, Г. С. Курмангалиева, Г. Р. Калжанбаева, М. К. Абдумананова Полиморфизм ccr5 гена у ВИЧ-инфицированных лиц г. Алматы // Вестник КазНМУ. 2016. № 1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/polimorfizm-ccr5-gena-u-vich-infitsirovannyh-lits-g-almaty (дата обращения: 02.03.2026).
6. Жарникова, В. Д. Оптимизация условий ПЦР для выявления мутаций гена CCR5 / В. Д. Жарникова, В. С. Давыденко // Студенческая наука — 2024: Материалы Всероссийского научного форума студентов с международным участием, Санкт-Петербург, 18–19 апреля 2024 года. — Санкт-Петербург: Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, 2024. — С. 712. — EDN YOGOHQ.